УДК 615.368:615.331:579
Ассистент О. С. Калюжная, доцент О.П. Стрилец, профессор Л.С. Стрельников
(Национальный фармацевтический университет) кафедра биотехнологии тел. (81038057) 7064787
Изучение адгезивных свойств 
микроорганизмов некоторых пробиотических препаратов 

Экспериментально изучены адгезивные свойства промышленных культур пробиотических препаратов. Установлено, что совместное культивирование данных микроорганизмов с кислотой молочной не снижает их адгезивную активность. Доказана перспективность их использования с кислотой молочной в составе одной лекарственной формы.  

The adhesive properties of industrial cultures of probiotic preparations were studied experimentally. It is found that co-cultivation of these microorganisms with lactic acid does not reduce their adhesive activity. Promising use of lactic acid in the composition of the same dosage form is proved.

Ключевые слова: пробиотические культуры, адгезия, кислота молочная, комплексный пробиотический препарат.

ВВЕДЕНИЕ
В процессе эволюции определенные группы микроорганизмов заселили нестерильные полости и слизистые оболочки тела человека. Нормофлора стала своеобразным органом, выполняющим определенные важные функции: защитную, метаболическую, десенсибилизирующую, дезинтоксикационную, регуляторную, иммуностимулирующую. Таким образом, специфический симбиоз человеческого организма с микробными популяциями превратился в единую микроэкологическую систему, гармонично функционирующую на пользу обоих составных частей [1].
Основным процессом, обеспечивающим взаимоотношения макро- и микроорганизмов, является адгезия. Адгезивность бактериальных клеток к эукариотическим является как одним из факторов патогенности условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, так и одним из механизмов защитного действия представителей нормофлоры. Сведения о молекулярных механизмах, обеспечивающих адгезию бактерий к эпителиальным клеткам, постоянно пополняются. Так, известно, что большое количество облигатных бактерий имеют специализированные лигандные структуры (адгезины), при помощи которых прикрепляются к строго определенным (комплементарным) рецепторам, находящимся на эпителии [2]. 
Имеются сведения, что у грамположительных бактерий, в том числе у бифидобактерий, лактобацил и пропионовокислых бактерий (основные представители облигатной нормофлоры), адгезинами являются липитейхоевые кислоты или лектины, входящие в состав их клеточных стенок [3].
Благодаря адгезии промышленные культуры, являющиеся основой пробиотических препаратов, могут успешно конкурировать с энтеропатогенными бактериями за рецепторы связывания эпителиальных клеток слизистых оболочек, то есть адгезивные свойства являются одним из показателей эффективности действия пробиотических препаратов на макроорганизм. Однако имеются сведения, что их адгезивность значительно ниже, чем адгезивность штаммов, выделенных от человека [4]. Именно чужеродностью пробиотических культур иногда объясняют тот факт, что положительный эффект от применения пробиотиков носит транзиторный характер [1, 5]. 
Также известно, что, несмотря на временный характер колонизации промышленных пробиотических культур, они служат триггер-фактором формирования местного иммунного ответа и способствуют ускорению колонизации слизистой другими родственными анаэробными представителями нормофлоры [6]. При этом, попав извне и став компонентом содержимого ЖКТ, они не способны вытеснять другие виды молочнокислых бактерий.
Эффективность пробиотических препаратов определяется совокупностью биологических свойств микроорганизмов, входящих в состав препаратов [7]. Повышение и расширение спектра биологической активности пробиотиков может быть достигнуто за счет разработки комплексных препаратов.
Исходя из всего вышесказанного, целью нашей работы было:
1) изучение адгезивных свойств некоторых промышленных культур, являющихся перспективными для создания комплексного пробиотического препарата;
2) исследование изменения адгезивной активности пробиотических культур при их совместном культивировании в связи с возможным конкурированием штаммов за экологические ниши;
3) определение влияния антимикробного компонента, который предлагается использовать в составе комплексного препарата, на адгезию как моно- так и смешанной пробиотических культур.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследований были промышленные культуры молочнокислых бактерий (МКБ), составляющие основу классических монопробиотиков «Лактобактерин сухой» и «Бифидумбактерин сухой». В работе использовали лактобактерин и бифидумбактерин производства ЧАО «Биофарма», Украина. 
На основании данных литературы и ранее проведенных комплексных микробиологических исследований были показаны высокие пробиотические свойства данных культур лакто- и бифидобактерий, подобрано их оптимальное соотношение в лекарственной форме [8]. 
В качестве антимикробного компонента использовали кислоту молочную, выбранную как перспективное составляющее комплексного пробиотического препарата. Предыдущими работами определена минимальная ингибирующая концентрация (МИК) кислоты молочной к разным видам условно-патогенных микроорганизмов, определена достаточно высокая устойчивость культур МКБ к действию кислоты молочной, показано повышение антимикробных свойств при совместном использовании культур МКБ с кислотой молочной [9]. 
В зависимости от поставленных задач исследования адгезивных свойств микроорганизмов проводили экспресс методом или развернутым методом по методики Брилиса [10].
В качестве клеток макроорганизма использовали эритроциты человека, которые могут быть универсальной моделью для изучения адгезии разных микроорганизмов благодаря наличию на поверхности эритроцитов гликофорина – вещества, идентичного гликокаликсу эпителиальных клеток, на которых размещены рецепторы для адгезинов микробов [10].
Пробиотические культуры выращивали в МПБ в течение 48 ч при температуре (37±1) °С, отделяли клетки от культуральной среды, дважды центрифугируя при 1000 об/мин в течение 10 мин. Бактериальную суспензию клеток готовили концентрацией 1·109 КОЕ/мл, добавляя к осадку буферный раствор – 0,1 М раствор натрия фосфата в растворе натрия хлорида изотонического (рН 7,2-7,3).
В экспериментах использовали нативные эритроциты. Кровь брали из локтевой вены в пробирки с гепарином (1 капля гепарина на 5 мл крови). Нативные эритроциты также дважды отмывали буферным раствором центрифугированием и готовили взвесь концентрацией 1·109 кл/мл. 
При исследовании адгезивных свойств экспресс методом на предметное стекло наносили каплю буферного раствора, в которой суспендировали по капле взвесей эритроцитов и микроорганизмов. Предметное стекло помещали во влажную камеру на 30 мин при температуре (37±1) °С. После этого препарат высушивали, фиксировали метанолом 10 мин, окрашивали по методу Грама и микроскопировали.
Развернутый метод использовали после совместного культивирования пробиотических штаммов, после совместного культивирования пробиотического штамма с условно-патогенными микроорганизмами, после культивирования пробиотических штаммов с кислотой молочной.
Взвеси эритроцитов и микроорганизмов готовили аналогично процедуре, описанной для экспресс метода. В пробирки вносили по 0,5 мл взвесей микроорганизмов и эритроцитов. Смесь инкубировали при температуре (37±1) °С в течение 30 мин на встряхивателе. После чего к смеси клеток одного из штаммов с эритроцитами добавляли взвесь другого штамма и повторно инкубировали в течение 10 мин.
При изучении влияния антимикробного компонента на штаммы лакто- и бифидобактерий инкубирование смеси клеток микроорганизмов с эритроцитами проводили в присутствии молочной кислоты, в концентрации ниже ее МИК к этим штаммам. 
Адгезивные свойства микроорганизмов оценивали по среднему показателю адгезии (СПА) (среднее количество микроорганизмов, прикрепившихся к одному эритроциту при подсчете не менее 25 эритроцитов, учитывая не более 5 эритроцитов в одном поле зрения), коэффициенту участия эритроцитов в адгезивном процессе (К) (процент эритроцитов, имеющих на своей поверхности прикрепленные микроорганизмы), индексу адгезивности микроорганизма (ИАМ) (среднее количество микробных клеток на одном эритроците).
ИАМ вычисляли по формуле:
,
где: СПА – средний показатель адгезии;
        К – коэффициент участия эритроцитов в адгезивном процессе.
Адгезивность считали нулевой при СПА от 0 до 1,0, низкой – от 1,01 до 2,0 и высокой при СПА больше 4,0. Микроорганизм считали неадгезивным при ИАМ ≤ 1,75, низкоадгезивным – от 1,76 до 2,5, среднеадгезивным – от 2,51 до 4,0 и высокоадгезивным при ИАМ выше 4,0.
Статистическую обработку проводили традиционными методами вариационной статистики. Средние арифметические значения и их доверительные интервалы определяли для уровня вероятности 95 %.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ
Адгезивные свойства монокультуры пробиотических штаммов, определяемые экспресс методом, представлены в таблице 1.
Таблица 1
Показатели адгезии лакто- и бифидобактерий
Объект исследования	Показатели адгезии, (М±m)	
	СПА, клеток	К, % эритроцитов	ИАМ, кл./эр.	
Лактобактерии	2,69 ± 0,10	74,86 ± 0,25	3,59 ± 0,14	
Бифидобактерии	3,01 ± 0,14	81,60 ± 0,28	3,69 ± 0,18	
Примечания:
n = 5; Р = 95 %; (М±m) – доверительный интервал.
Данные таблицы 1 свидетельствуют о том, что исследуемые пробиотические штаммы относятся к среднеадгезивным.
Одним из принципов создания комплексного пробиотического препарата является отсутствие конкурирования между разными видами МКБ за экологические ниши, что можно проверить изучением адгезивных свойств смешанной пробиотической культуры.
Исходя из задания, поставленного перед нами, – создание комплексного пробиотического препарата с антимикробным компонентом, – необходимо было определить, как изменяются адгезивные свойства выбранных пробиотических штаммов в смешанной культуре и моно- и смешанной культур МКБ под влиянием кислоты молочной. 
Показатели адгезии для вышеуказанных случаев представлены в таблицах 2 и 3.
Таблица 2
Показатели адгезии смешанной культуры лакто- и бифидобактерий 
Исследуемый штамм	Вторичный штамм	Показатели адгезии, (М±m)	
		СПА, клеток	К, % эритроцитов	ИАМ, кл./эр.	
Лактобактерии	Бифидобактерии 	2,88 ± 0,09	73,01 ± 0,55	3,94 ± 0,27	
Бифидобактерии	Лактобактерии	3,06 ± 0,09	80,02 ± 0,76	3,82 ± 0,28	
Примечания:
n = 5; Р = 95 %; (М±m) – доверительный интервал.
Таблица 3
Показатели адгезии моно- и смешанной культур лакто- и бифидобактерий при культивировании с молочной кислотой 
Объект исследования	Показатели адгезии, (М±m)	
	СПА, клеток	К, % эритроцитов	ИАМ, кл./эр.	
Лактобактерии	2,81 ± 0,05	74,86 ± 0,20	3,75 ± 0,16	
Бифидобактерии	2,97 ± 0,10	81,52 ± 0,43	3,64 ± 0,29	
Смешанная культура	2,78  ± 0,05	72,78 ± 0,85	3,82 ± 0,18	
Примечания:
n = 5; Р = 95 %; (М±m) – доверительный интервал.
Сравнение показателей адгезии объектов в моно- и смешанной культур и при их инкубировании с молочной кислотой показало незначительное изменение адгезивной способности исследуемых штаммов при сохранении степени адгезивности каждой пробиотической культуры на присущем ей уровне.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
С учетом экспериментальных данных, полученных предыдущими исследованиями и в настоящей работе, можно утверждать, что введение кислоты молочной в концентрации ниже, чем предварительно определенная МИК, не влияет на жизнеспособность клеток лакто- и бифидобактерий, не снижает показатели пробиотической активности исследуемых культур – антагонизм и адгезию; повышает антимикробную активность пробиотиков с сохранением адгезивных свойств штаммов МКБ. 
Таким образом данные результаты свидетельствуют об отсутствии конкурирования промышленных штаммов лакто- и бифидобактерий, что подтверждает возможность их совместного использования с кислотой молочной в составе одной лекарственной формы.
ЛИТЕРАТУРА 
1. Бережной, В.В. Нарушения микробной экологии человека, их причины, следствия и способы восстановления физиологической нормы [Текст] / В. В. Бережной, Д. С. Янковский, С. А. Крамарев и др. // Здоровье женщины. – 2004. – № 2 (18). – С. 170–178.
2. Брилене, Т.А. Адгезия лактобацилл влагалища и половые гормоны [Текст]: автореф. дис… канд. медиц. наук : спец. 03.00.07 «Микробиология» / Т. А. Брилене. – М., 1990. – 21 с.
3. Chan, R.C.Y. Competitive exclusion of uropathogens from human uroepithelial cells by Lactobacillus whole cells and cell wall fragments / R.C.Y.Chan, G. Reid, R.T. Irvin, A.W. Bruce, J.W. Costerton // Infect. Immun.- 1985. – v.47.- p. 84-89.
4. Tuomola, E.M. Adhesion of some probiotic and dairy Lactobacillus strains to Caco-2 cell cultures / E.M. Tuomola, S.J. Salminen // Int-J-Food-Microbiol. – 1998. – 41(1). – р. 45-51.
5. Schillinger, U. In vitro adherence and other properties of lactobacilli used in probiotic yoghurt-like products / U. Schillinger, С. Guigas, W.H. Holzapfel // International Dairy Journal. – 2005. – V. 15, No. 12. – p. 1289-1297.
6. Долинин, М. Ф. Адгезины микроорганизмов [Текст] / М. Ф. Долинин, Н. Г. Фиш // Итоги науки и техники. – М., 1985. – Т. 16. – С. 3–108. 
7. Царукьянова, И.Г. Изучение адгезивных свойств бактерий, перспективных для создания комплексного пробиотического препарата [Текст] / И.Г. Царукьянова, Е.В. Смирнова // Мікробіологічний журнал. – 2005. – Т. 67, № 2. – С. 88–95.
8. Калюжная О.С. Мікробіологічне обґрунтування створення пробіотичного препарату для профілактики та лікування вагінальних дисбіозів [Текст] / О.С. Калюжная, Л.С. Стрельников, О.П. Стрілець // Фармаком. – 2009. – № 1. – С. 55-60
9. Калюжная, О.С. Разработка суппозиториев для профилактики и лечения вагинальных дисбиозов [Текст] / О.С. Калюжная, Л.С. Стрельников, О.П. Стрилец, Г.И. Кабачный // Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства : междунар. науч.-практ. конф., 15-16 мая 2009 г. – Шимкент, 2009. – С. 46-48.
10. Брилис, В.И. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов [Текст] / В.И. Брилис, Т.А. Брилене, Х.П. Ленцнер, А.А.Ленцнер // Лабораторное дело. – 1986. – № 4. – С. 210–213.

Study of the adhesive properties of some microorganisms of probiotic preparations
Kalyuzhnaya O.S., Strilets O.P.,
Strelnikov L.S.
National University of Pharmacy
Department of Biotechnology