Визначення дифегідраміну ВЕРХ-методом у біологічних рідинах

Abstract

Метою дослідження є розробка алгоритму спрямованого аналізу дифенгідраміну у біологічних екстрактах із сечі та крові при застосуванні уніфікованої методики дослідження ВЕРХ- методом. Матеріали та методи. Екстракцію дифенгідраміну проводили хлороформом при рН 9,0. Очистку екстрактів від домішок виконували при сполученні ТШХ і екстракції гексаном. ТШХ-очистку та ідентифікацію дифенгідраміну проводили в оптимальних умовах: системи органічних розчинників - хлороформ – метанол (90:10); метанол; метанол-25% розчин амонію гідроксиду (100: 1,5) і хроматографічні пластинки - Сорбфіл ПСТХ-АФ-А, Сорбфіл ПСТХ-П-В-УФ. Для детектування дифенгідраміну використовували найбільш чутливі проявники - УФ-світло (λ = 254 нм) і реактив Драгендорфа у модифікації за Муньє. ВЕРХ-аналіз проводили на мікроколоночному рідинному хроматографі "Міліхром А-02" в умовах: обернено-фазовий варіант, колонка з неполярним сорбентом Prontosil 120-5 C18 AQ, 5 мкм; рухлива фаза у режимі лінійного градієнту - від елюенту А (5% ацетонітрил і 95% буферний розчин) до елюенту В (100% ацетонітрил) протягом 40 хв. Швидкість потоку рухомої фази складала 100 мкл / хв, об'єм проби - 4 мкл. Багатоканальне детектування речовини проводили з використанням УФ-спектрофотометру при 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 і 300 нм; оптимальне значення температури колонки - 37 - 40ºС та тиску насоса - 2,8 – 3,2 МПа.Результати та їх обговорення. Проведено екстракцію, очистку, ідентификацію та кількісне визначення дифенгідраміну за розробленими методиками. Встановлено, що при ізолюванні дифенгідраміну з крові можна виділити 34,2 – 38,4 % речовини ( = ± 5,69 %, RSD = 2,04 %) та із сечі - 55,8 – 60,5 % речовини ( = ± 3,91 %, RSD = 1,40% ). Висновки. Розроблено алгоритм спрямованого аналізу дифенгідраміну у біологічних екстрактах із сечі та крові при застосуванні уніфікованої методики дослідження ВЕРХ- методом. Статистична обробка результатів експерименту свідчить про надійність і відтворюваність методики.

Целью исследования является разработка алгоритма направленного анализа дифенгидрамина в биологических экстрактах из мочи и крови при использовании унифицированной методики исследования ВЭЖХ- методом. Материалы и методы. Экстракцию дифенгидрамина проводили хлороформом при рН 9,0. Очистку экстрактов от примесей выполняли при сочетании ТСХ и экстракции гексаном. ТСХ-очистку и идентификацию дифенгидрамина проводили в оптимальных условиях: системы органических растворителей - хлороформ - метанол (90:10); метанол; метанол-25% раствор аммония гидроксида (100:1,5) и хроматографические пластинки - Сорбфил ПСТХ-АФ-А, Сорбфил ПСТХ-П-В-УФ. Для детектирования дифенгидрамина использовали наиболее чувствительные проявители - УФ-свет (λ = 254 нм) и реактив Драгендорфа в модификации по Мунье. ВЭЖХ-анализ проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе "Милихром А-02" в условиях: обращенно-фазный вариант, колонка с неполярным сорбентом Prontosil 120-5 C18 AQ, 5 мкм; подвижная фаза в режиме линейного градиента - от элюента А (5% ацетонитрил и 95% буферный раствор) до элюента В (100% ацетонитрил) в течение 40 мин. Скорость потока подвижной фазы составляла 100 мкл / мин, объем пробы - 4 мкл. Многоканальное детектирование вещества проводили с использованием УФ-спектрофотометра при 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 и 300 нм; оптимальное значение температуры колонки -37 - 40ºС и давления насоса - 2,8 – 3,2 МПа. Результаты и их обсуждение. Проведено экстракцию, очистку, идентификацию и количественное определение дифенгидрамина по разработанным методикам. Установлено, что при изолировании дифенгидрамина из крови можно выделить 34,2 – 38,4 % вещества ( = ± 5,69 %, RSD = 2,04 %) и из мочи - 55,8 – 60,5 % вещества ( = ± 3,91 %, RSD = 1,40% ). Выводы. Разработан алгоритм направленного анализа дифенгидрамина в биологических экстрактах из мочи и крови при применении унифицированной методики исследования ВЭЖХ-методом. Статистическая обработка результатов эксперимента свидетельствует о надежности и воспроизводимость методики.

The aim of the study is to develop an algorithm for directed analysis of diphenhydramine in biological extracts from urine and blood using a unified method of HPLC research. Materials and methods. The extraction of diphenhydramine was carried out with chloroform at pH 9.0. The extracts were purified from impurities by a combination of TLC and extraction with hexane. TLC purification and identification of diphenhydramine were carried out under optimal conditions: organic solvents systems – chloroform-methanol (90:10); methanol; methanol-25% solution of ammonium hydroxide (100:1.5) and chromatographic plates - Sorbfil PTLC-AF-A, Sorbfil PTLC-P-B-UV. For the detection of diphenhydramine, the most sensitive location reagents were used - UV light (λ = 254 nm) and reagent Dragendorff in the modification of Mounier. HPLC analysis was carried out on a microcolumn liquid chromatograph "Milichrome A-02" in conditions: reversed-phase variant, column with non-polar sorbent Prontosil 120-5 C18 AQ, 5 μm; mobile phase in the mode of linear gradient – from eluent А (5 % acetonitrile and 95% buffer solution) to eluent B (100% acetonitrile) as during 40 min. The flow rate of the mobile phase has been formed 100 μl/min, injection volume – 4 μl. Multichannel detection of the substance was carried out using a UV spectrophotometer at 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 and 300 nm; the optimal value of column temperature – 37 - 40С and pressure of pump – 2.8 – 3.2 MPa. Results and its discussion. Extraction, purification, identification and quantitative determination of diphenhydramine were carried out according to the developed methods. It is established that when isolating diphenhydramine from blood according to the developed methods it is possible to allocate 34.2 – 38.4 % of substance ( = ± 5.69 %, RSD = 2.04 %) and from urine – 55.8 – 60.5 % of substance ( = ± 3.91 %, RSD = 1.40% ). Conclusions. An algorithm has been developed for directed analysis of diphenhydramine in biological extracts from urine and blood using a unified HPLC method. Statistical processing of the experimental results indicates the reliability and reproducibility of the technique.