Розробка та валідація методик визначення секнідазолу для хіміко-токсикологічного аналізу

Abstract

Дисертацію присвячено комплексному хіміко-токсикологічного аналізу біоло- гічних рідин на секнідазол. Досліджено поведінку секнідазолу в умовах систематичного токсикологічного ТШХ-аналізу в комбінації з кольоровими реакціями на пластинах. Розроблено мето- дики виявлення та кількісного визначення секнідазолу за допомогою методів СФ, ВЕРХ/УФ, ВЕРХ/МС, ГРХ/ПІД і ГРХ/МС, проведено їх валідацію за модельними розчинами у варіантах застосування МКГ, МС та МД. Вивчено кислотно-основні рівноваги секнідазолу у водних розчинах та сумішах води з амфіфільними розчинниками (1:1) та досліджено ефективність екстракції се- кнідазолу з водних розчинів в двох напрямках – рідинно-рідинна екстракція органі- чними розчинниками, що не змішуються з водою, та рідинна екстракція амфіфіль- ними розчинниками. Запропоновано методики пробопідготовки біологічних рідин для їх аналізу на секнідазол, проведено їх валідацію у варіантах МКГ, МС та МД; зроблено прогноз сумарної невизначеності методик.

Диссертация посвящена комплексному химико-токсикологическому анализу биологических жидкостей на секнидазол. Исследовано поведение секнидазола и других производных 5-нитроимидазола при проявлении общепринятыми реагентами на пластинах для ТСХ. Положительные результаты зафиксированы при обработке реактивами, исполь- зующимися в анализе производных барбитуровой кислоты. При обработке исследу- емых препаратов по схемам ТСХ-скрининга веществ основного и кислотного харак- тера положительные результаты получены только при применении подкисленного раствора KMnO4. Предложены модифицированные схемы обработки исследуемых веществ нингид- рином, п-ДМАБ и йодоплатинатом. В качестве специфического проявителя для ве- ществ, содержащих нитрогруппу, предложены спиртовый и водный растворы щелочи. Установлены значения Rf секнидазола в условиях хроматографирования в стан- дартных и частных подвижных фазах. Подобраны некоррелирующие подвижные фазы для идентификации секнидазола. Исследованы закономерности светопоглощения секнидазола в УФ-области спектра с использованием различных растворителей. Разработаны три методики ко- личественного определения секнидазола методом СФ с использованием 0,1 М HCl, 96% C2H5OH и 0,1 М NaOH в качестве растворителей, проведена их валидация в ва- риантах МКГ, МС и МД. Проведено обнаружение и разработана ВЭЖХ/УФ-методика определения секнидазола с использованием системы ВЭЖХ-анализатора Milichrome® A-02; вре- мя удерживания секнидазола составляет 8,16 мин. Подобраны условия обнаружения и разработана методика количественного определения секнидазола с использовани- ем метода ВЭЖХ/МС, время удерживания для секнидазола составляет 6,51 мин. Предложены условия обнаружения секнидазола с использованием методов ГЖХ/ПИД и ГЖХ/МС; время удерживания секнидазола составляет 8,97 мин. и 11,74 мин. соответственно; разработаны ГЖХ/ПИД- и ГЖХ/МС-методики количествен- ного определения секнидазола, проведена их валидация в вариантах МКГ, МС и МД. Исследованы кислотно-основные равновесия секнидазола в водных растворах и смесях воды с амфифильными растворителями (1:1) – в сильно щелочной среде (выше 4 М NaOH) существует анионная форма секнидазола R– (максимумы погло- щения при 240 и 294 нм), при дальнейшем уменьшении значения рН появляется мо- лекулярная форма RH (максимумы поглощения при 232 и 319 нм), в сильно кислой среде (рН < 1,7)существует конечный продукт преобразований – протонированная форма H2R+ (максимум поглощения при 277 нм). На спектрах поглощения секнида- зола наблюдаются четыре изобестические точки, характеризующие два протолити- ческих равновесия (равновесие RH/H2R+ – 240 и 295 нм, равновесие RH/R– – 261 и 297 нм). Положение изобестичних точек равновесия RH/R– колеблется в диапазоне ± 3 нм, что, на наш взгляд, связано с наличием таутомерных преобразований для мо- лекулярной формы секнидазола. Константа равновесия RH/H2R+ определена методом спектрофотометрического титрования, ее показатель составляет 2,31 для воды, 2,46 – для смеси воды и изо- пропанола (1:1), 2,63 – для смеси воды и ацетонитрила (1:1), 2,40 – для смеси воды и этанола (1:1). Определить константу равновесия RH/R– указанным методом невоз- можно. Для обоснования процедур пробоподготовки биологических жидкостей для определения в них секнидазола исследована эффективность экстракции секнидазола из водных растворов в зависимости от рН среды с применением жидкостно- жидкостной экстракции хлороформом и смесью хлороформ – изопропанол (8:2) по- сле предварительного высаливания аммония сульфатом и без него, а также изопро- панолом, ацетонитрилом и этанолом с последующим высаливанием и после предва- рительного высаливания аммония сульфатом. С учетом результатов исследования экстракции выделены оптимальные пути изолирования секнидазола из биологических жидкостей (реагенты для разрыва свя- зей секнидазола с компонентами биологической матрицы и осаждения белков и форменных элементов крови, растворители для настаивания и экстракции и т.д.), условия экстракционной очистки полученных извлечений из биологического мате- риала, пути концентрирования секнидазола, методики ТШХ- и ТФ-очистки органи- ческих извлечений из биологического материала. Подтверждена воспроизводимость величин степени извлечения секнидазола из крови и мочи в пределах диапазона применения методик количественного опреде- ления; проведен основной этап валидации методик количественного определения секнидазола в крови и моче по таким параметрам, как линейность/калибровочная модель, правильность и прецизионность с использованием образцов матрицы в ва- риантах МКГ, МС и МД.

The thesis is devoted to complex chemical-toxicological analysis of biological liquids for secnidazole. The behaviour of secnidazole under systematic toxicological TLC-analysis in combination with colour reactions on the plates has been investigated. The procedures for detection and quantitative determination of secnidazole by the methods of spectrophotometry, HPLC/UV, HPLC/MS, GLC/FID and GLC/MS have been developed, their validation in the variants of MCC, MS and MA has been carried out using model solutions. Acid-base equilibria of secnidazole in aqueous solutions and mixtures of water with amphiphilic solvents (1:1) have been studied and efficiency of secridazole extraction from aqueous solutions in two directions has been investigated – liquid-liquid extraction with organic solvents immiscible with water and liquid extraction by amphiphilic solvents. The procedures of sample preparation of biological liquids for their analysis for secnidazole have been proposed, their validation in the variants of MCC, MS and MA has been carried out; the total uncertainty of the procedures has been calculated.