Development and validation of HPLC/UV-procedures for quantification of metronidazole in blood and urine

Abstract

Metronidazole belongs to the group of antiprotozoal medicines and widely used for the treatment of infectious diseases; the medicine has a number of side effects manifested by usual symptoms of acute intoxication, especially when interacting with other drugs and alcohol. Aim. To apply the system of MiLiChrome® A-02 HPLC-analyzer widely used in the Ukrainian laboratories of forensic toxicology for the metronidazole quantitative determination in biological fluids and carry out validation of the procedures developed. Materials and methods. The sample preparation of blood and urine was carried out by extraction with acetonitrile and 2-propanol followed by separation of the organic layer under the conditions of the aqueous phase saturation with ammonium sulfate. Previously blood and urine were treated with acids. Isolation was carried out in the strong acid, neutral and weak alkaline medium. Results and discussion. To find the optimal conditions of the sample preparation such validation parameters as specificity/selectivity and recovery were determined. The results of the blank samples analysis were acceptable for all variants of the sample preparation procedures. Recovery values were reproducible for all procedures of analysis studied, but efficacy of metronidazole isolation was variable – from 85 % to 97 %. The results of verification of metronidazole stability showed the necessity to carry out all measurements within 12 hours after obtaining the solutions to be analyzed. The results of determination of linearity, accuracy and precision were the evidence of acceptable systematic and random errors of the HPLC/UV-procedures studied in the variant of the method of calibration curve, method of standard and method of additions. Conclusions. The set of HPLC/UV-procedures for the metronidazole quantitative determination in blood and urine has been developed. Validation of the procedures developed has been carried out.

Метронідазол належить до групи антипротозойних засобів і широко застосовується для лікування інфекційних захворювань; препарат має ряд побічних ефектів, що виявляються звичайними симптомами гострої інтоксикації, особливо при взаємодії з іншими препаратами і алкоголем. Мета. Застосувати систему ВЕРХ-аналізатора MiLiChrome® A-02, що широко використовується в українських судово-токсикологічних лабораторіях, для кількісного визначення метронідазолу в біологічних рідинах і провести валідацію розроблених методик. Матеріали та методи. Пробопідготовку крові і сечі проводили шляхом екстракції ацетонітрилом і ізопропанолом з подальшим відділенням органічного шару в умовах насичення водної фази амонію сульфатом. Попередньо кров і сечу обробляли кислотами. Ізолювання проводили в сильнокислому, нейтральному і слабколужному середовищі. Результати та їх обговорення. Для підбору оптимальних умов пробопідготовки були визначені такі валідаційні параметри як специфічність/селективність і ступінь ізолювання. Результати аналізу blank-проб прийнятні для всіх варіантів процедур пробопідготовки. Значення ступеня ізолювання відтворювані для всіх вивчених процедур аналізу, але ефективність виділення метронідазолу різна – від 85 % до 97 %. Результати перевірки стабільності метронідазолу показали необхідність проведення всіх вимірювань впродовж 12 годин після отримання аналізованих розчинів. Результати визначення лінійності, правильності та прецизійності свідчать про допустимість систематичних і випадкових помилок досліджених ВЕРХ/УФ-методик у варіанті методу калібрувального графіка, методу стандарту та методу добавок. Висновки. Розроблено комплекс ВЕРХ-методик для кількісного визначення метронідазолу в крові і сечі. Проведено валідацію розроблених методик.

Метронидазол относится к группе антипротозойных препаратов и широко применяется для лечения инфекционных заболеваний; препарат имеет ряд побочных эффектов, проявляющихся обычными симптомами острой интоксикации, особенно при взаимодействии с другими препаратами и алкоголем. Цель. Применить систему ВЭЖХ-анализатора MiLiChrome® A-02, широко используемую в украинских судебно-токсикологических лабораториях, для количественного определения метронидазола в биологических жидкостях и провести валидацию разработанных методик.Материалы и методы. Пробоподготовку крови и мочи проводили путем экстракции ацетонитрилом и изопропанолом с последующим отделением органического слоя в условиях насыщения водной фазы аммония сульфатом. Предварительно кровь и мочу обрабатывали кислотами. Изолирование проводили в сильнокислой, нейтральной и слабощелочной среде. Результаты и их обсуждение. Для подбора оптимальных условий пробоподготовки были определены такие валидационные параметры, как специфичность/селективность и степень извлечения. Результаты анализа blank-проб приемлемы для всех вариантов процедур пробоподготовки. Значения степени извлечения воспроизводимы для всех изученных процедур анализа, но эффективность выделения метронидазола различна – от 85 % до 97 %. Результаты проверки стабильности метронидазола показали необходимость проведения всех измерений в течение 12 часов после получения анализируемых растворов. Результаты определения линейности, правильности и прецизионности свидетельствуют о допустимости систематических и случайных ошибок изученных ВЭЖХ/УФ-методик в варианте метода калибровочного графика, метода стандарта и метода добавок. Выводы. Разработан комплекс ВЭЖХ-методик для количественного определения метронидазола в крови и моче. Проведена валидация разработанных методик.