Розробка та валідація ензимної кінетико-фотометричної методики визначення залишкових кількостей деквалінію хлориду на поверхні фармацевтичного обладнання

Abstract

Мета. Розробка та валідація нової ензимної кінетико-фотометричної методики аналізу деквалінію хлориду, що ґрунтується на використанні реакції ферментного гідролізу ацетилхоліну, для визначення залишкових кількостей деквалінію хлориду при здійсненні контролю повноти очищення фармацевтичного обладнання. Результати та обговорення. Встановлені оптимальні умови перебігу ензимної реакції – порядок змішування та концентрації ацетилхоліну (0,05 мг/мл), холінестерази (0,4 мг/мл), водню пероксиду (10 %) та п-фенетидину (1 %), час витримування реакційної суміші (20 хв), рН середовища (8,35), вплив природи буферного розчину. Проведено валідацію розробленої методики – запропоновано діапазон застосування методики (40–160 % в нормалізованих координатах, за 100 % обрано максимально допустиму концентрацію деквалінію хлориду в змивах з фармацевтичного обладнання хcrit = 0,5 мкг/мл), кількість концентраційних рівнів (n = 7) та порядок їх розташування всередині діапазону застосування, з урахуванням чого розраховано максимально допустиму невизначеність методики (maxΔx = 3,05 %) і, відповідно, критерії прийнятності параметрів лінійної залежності, систематичної та випадкової похибок. Показано, що валідаційні характеристики розробленої методики відповідають розрахованим критеріям прийнятності. Встановлено ступінь екстракції деквалінію хлориду зі свабу зі змивом з фармацевтичного обладнання. Експериментальна частина. Визначення залишкових кількостей деквалінію хлориду на поверхні фармацевтичного обладнання визначали за ступенем інгібування ензимної реакції, який оцінювали за залишком субстрату біохімічної реакції – ацетилхоліну, що не прореагував. Визначення залишкової кількості ацетилхоліну в реакційній суміші виконували кінетико-фотометричним методом за індикаторною реакцією окиснення n-фенетидину надацетатною кислотою (утворюється під час допоміжної реакції пергідролізу при додаванні до реакційної суміші надлишку водню пероксиду), реєструючи світлопоглинання утворюваного продукту реакції – азоксифенетолу (λmax = 358 нм) впродовж певного періоду часу. Висновки. Розроблено ензимну кінетико-фотометричну методику визначення залишкових кількостей деквалінію хлориду на поверхні фармацевтичного обладнання після його очищення. Проведено валідацію розробленої методики за такими параметрами, як лінійність, правильність, прецизійність та межа кількісного визначення.

Aim. To develop and validate the new enzymatic kinetic photometric procedure for analysis of dequalinium chloride based on application of enzymatic acetylcholine hydrolysis to determine the residual quantities of dequalinium chloride while monitoring the completeness of cleaning of the pharmaceutical equipment. Results and discussion. The optimal conditions for the enzymatic reaction course were determined – the order of mixing and the concentration of acetylcholine (0.05 mg/mL), cholinesterase (0.4 mg/mL), hydrogen peroxide (10 %) and p-phenetedine (1 %), the time of the reaction mixture maintaining (20 min), pH (8.35), the effect of the nature of the buffer solution. Validation of the procedure developed was carried out – the application range of the procedure was proposed (40–160 % in the normalized coordinates, the maximum acceptable concentration of dequalinium chloride in washes from the pharmaceutical equipment хcrit = 0.5 μg/mL), the number of concentration levels (n = 7); the order of their location within the application range, taking these data into account the maximum acceptable uncertainty of the procedure (maxΔx = 3.05 %) and the acceptability criteria for linear dependence parameters, systematic and random errors were calculated. The validation characteristics of the procedure developed were shown to correspond to the acceptability criteria calculated. The degree of extraction of dequalinium chloride from swabs with flushing from the pharmaceutical equipment was determined. Experimental part. The residual quantities of dequalinium chloride on the surface of the pharmaceutical equipment were determined by the degree of inhibition of the enzymatic reaction assessed by the unreacted residue of the substrate of the biochemical reaction, such as acetylcholine. The residual quantities of acetylcholine in the reaction mixture was determined by the kinetic photometric method by the indicator reaction of p-phenetidine oxidation with peracetic acid (formed during the auxiliary perhydrolysis reaction when adding an excess of hydrogen peroxide to the reaction mixture) in the way of registering the light absorbance of the resulting reaction product – azoxifenetole (λmax = 358 nm) for a definite period of time. Conclusions. The enzymatic kinetic photometric procedure has been developed to determine the residual quantities of dequalinium chloride on the surface of the pharmaceutical equipment after its cleaning. The procedure developed has been validated by such parameters as linearity, accuracy, precision and the limit of quantification.

Цель. Разработка и валидация новой энзимной кинетико-фотометрической методики анализа деквалиния хлорида, основанной на использовании реакции ферментного гидролиза ацетилхолина, для определения остаточных количеств деквалиния хлорида при проведении контроля полноты очистки фармацевтического оборудования. Результаты и обсуждение. Установлены оптимальные условия протекания энзимной реакции – порядок смешивания и концентрации ацетилхолина (0,05 мг/мл), холинэстеразы (0,4 мг/мл), пероксида водорода (10 %) и п-фенетидина (1 %), время выдерживания реакционной смеси (20 мин), рН среды (8,35), влияние природы буферного раствора. Проведена валидация разработанной методики – предложен диапазон применения методики (40–160 % в нормализованных координатах, за 100 % взята максимально допустимая концентрация деквалиния хлорида в смывах с фармацевтического оборудования хcrit = 0,5 мкг/мл), количество концентрационных уровней (n = 7) и порядок их расположения внутри диапазона применения, с учетом чего рассчитана максимально допустимая неопределенность методики (maxΔх = 3,05 %) и, соответственно, критерии приемлемости параметров линейной зависимости, систематической и случайной погрешностей. Показано, что валидационные характеристики разработанной методики соответствуют рассчитанным критериям приемлемости. Установлена степень экстракции деквалиния хлорида из свабов со смывом с фармацевтического оборудования. Экспериментальная часть. Определение остаточных количеств деквалиния хлорида на поверхности фармацевтического оборудования определяли по степени ингибирования энзимной реакции, которую оценивали по непрореагировавшему остатку субстрата биохимической реакции – ацетилхолина. Определение остаточного количества ацетилхолина в реакционной смеси выполняли кинетико-фотометрическим методом по индикаторной реакции окисления n-фенетидина перуксусной кислотой (образуется в ходе вспомогательной реакции пергидролиза при добавлении к реакционной смеси избытка пероксида водорода), регистрируя светопоглощение образующегося продукта реакции – азоксифенетола (λmax = 358 нм) в течение определенного периода времени. Выводы. Разработана энзимная кинетико-фотометрическая методика определения остаточных количеств деквалиния хлорида на поверхности фармацевтического оборудования после его очистки. Проведена валидация разработанной методики по таким параметрам, как линейность, правильность, прецизионность и предел количественного определения.