Приготування ліпосом із фосфоліпідами та дослідження їх фотовзаємодії із флуорофор-місткою сполукою

Abstract

Мета роботи – обґрунтувати оптимальну технологію отримання двох видів біоспоріднених ліпосом на основі композиції дипальмітоїл-L-α-фосфатидилхолін (DPPC) або пальмітоїлсфінгомієлін-N-гесадеканоїл-D-еритросфінгозилфосфорилхолін (С16-SM) із холестеролом та дослідження їх фотовзаємодії із флуорофор-місткою сполукою. Матеріали та методи. Для приготування ліпосомальних везикул на основі фосфоліпідів – DPPC, С16-SM та холестеролу (1:1) було використано метод зворотнофазового випаровування на ротаційному вакуумному випаровувачі Bϋchi-210. Гомогенізацію ультразвуком проводили за допомогою сонікатора Jeken (Codyson) PS-08A. Флуоресцентну сполуку R-203 (5’-iзопропіл-3’-((4-метил-2-oксо-2Н-хромен-7-їл)-карбамоїл)-2-оксоспіро-[індолін- 3,2’-піролідин]-4’-карбонову кислоту) із 7-амінокумариновим (7-АМК) флуорофором отримували шляхом раніше описаного синтезу. Визначення розміру частинок ліпосом здійснювали за допомогою лазерної дифракції на приладі LA-960 Laser Particle Size Analyzer (Horiba Scientific). Діапазон вимірювання приладу складає від 0,01 мкм до 5000 мкм; гарантована точність ± 0,6 %. Реєстрацію спектрів флуоресценції проводили в діапазоні емісії 365…650 нм на спектрофлуориметрі FluoroMax®-4 (Horiba Scientific) за довжини збуджувальної хвилі 350 нм. Спектри флуоресценції R-203 (λem = 412 нм) вимірювали в кюветі об’ємом 500 мкл. Результати та їх обговорення. Цільові ліпосоми було отримано на базі композиції DPPC або С16-SM із холестеролом у співвідношенні фосфоліпідів та холестеролу 1:1. Оптимального розміру ліпосом близько 100 нм вдалося досягти для складу С16-SM : холестерол (1:1). Розрахований параметр пакування (γ) дозволив зробити висновок, що у випадку фосфоліпідів DPPC та С16-SM параметр γ < 1, тобто молекули цих ліпідів мають форму конуса та упаковуються у фазу І типу, де молекули можуть утворювати сферичні (везикули) та/або циліндричні міцели. Однак фосфоліпід С16-SM має більшу полярну площу молекули (a0), на відміну від молекули DPPC. Досліджено спектри флюоресценції за взаємодії R-203 із ліпосомами DPPC : холестерол та С16-SM : холестерол (1:1) у фосфатно-сольовому буфері з рН 7,4. За взаємодії флуоресцентної речовини R-203 спостерігали гасіння інтенсивності флуоресценції згідно з рівнянням Штерна-Фольмера, більш інтенсивне для ліпосом С16-SM : холестерол, ніж у випадку ліпосом DPPC : холестерол. Висновки. Запропоновано оптимальну технологію отримання двох видів біоспоріднених ліпосом на базі композиції DPPC або С16-SM із холестеролом (1:1) на основі методу зворотнофазового випарювання із оброблянням ультразвуком, визначено контрольні параметри цієї технології. Ліпосоми, отримані на основі С16-SM, більш інтенсивно взаємодіють із 7-АМК-флуорофором сполуки R-203 у буфері.

Aim. To substantiate the optimal technology for obtaining two types of bio-related liposomes based on the composition of dipalmitoyl-L-α-phosphatidylcholine (DPPC) or palmitoyl-sphingomyelin-N-hesadecanoyl-D-erythrosphingosylphosphorylcholine (C16-SM) with cholesterol and study their interaction with a fluorophore-containing compound. Materials and methods. To prepare liposomal vesicles based on phospholipids – DPPC, C16-SM and cholesterol (1:1) the method of reverse-phase evaporation on a rotary vacuum evaporator Bϋchi-210 was used. Ultrasonic homogenization was performed using a Jeken (Codyson) PS-08A sonicator. A fluorescent compound R-203 (5’-isopropyl-3’- ((4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-yl) -carbamoyl) -2-oxospiro-[indoline-3,2’-pyrrolidine] -4’-carbon) with a 7-amino-coumarin (7-AMC) fluorophore was obtained by the synthesis previously described. Liposome particle size determination was measured using laser diffraction on a LA-960 Laser Particle Size Analyzer (Horiba Scientific). The measuring range of the device is 0.01 μm to 5000 μm; guaranteed accuracy is ± 0.6 %. Fluorescence spectra were recorded in the emission range of 365… 650 nm on a FluoroMax®-4 spectrofluorometer (Horiba Scientific) at an excitation wavelength of 350 nm. R-203 fluorescence spectra (λem = 412 nm) were measured in a 500 μl cuvette. Results and discussion. Target liposomes were obtained based on the composition of DPPC or C16-SM phospholipids with cholesterol in the ratio of phospholipids and cholesterol 1:1. The optimal size of liposomes of about 100 nm was achieved for the composition of C16-SM: cholesterol (1:1). The calculated packaging parameter (γ) allowed us to conclude that in the case of DPPC and C 16-SM phospholipids, the parameter γ < 1, i.e. the molecules of these lipids had a cone shape and were packed in phase I type where the molecules could form spherical (vesicles) and / or cylindrical micelles. However, the C16-SM phospholipid has a larger polar area of the molecule (a0), in contrast to the DPPC molecule. Fluorescence spectra of R-203 interaction with DPPC : cholesterol and C16-SM : cholesterol (1:1) liposomes in phosphate-buffered saline pH 7.4 were studied. In the interaction of the fluorescent substance R-203, quenching of the fluorescence intensity was observed according to the Stern–Volmer equation; it was more intense for C 16-SM: cholesterol liposomes than in the case of DPPC: cholesterol liposomes. Conclusions. The optimal technology for obtaining two types of bio-related liposomes based on the composition of DPPC or C 16-SM with cholesterol (1: 1) has been proposed using the method of reverse phase evaporation with ultrasound treatment; the control parameters of their technology have been determined. Liposomes based on C16-SM interact more intensively with the 7-AMK fluorophore of the compound R-203 in the buffer.