The identification and quantitative determination of amitriptyline by the HPLC-MWD method

Abstract

Aim. To develop the sensitive and specific HPLC-MWD method for the determination of amitriptyline suitable for use in bioanalytical studies in clinical and forensic toxicology.Materials and methods. The analysis was performed on a “MiLiChrome A-02” microcolumn liquid chromatograph attached to a dual-beam multi-wave UV spectrophotometer under the following conditions: 2×75 mm column ProntoSIL 120-5-C18 AQ, 5 μm; the gradient elution mode with a linear gradient, eluent A (5 % acetonitrile and 95 % perchlorate buffer) to eluent B (100 % acetonitrile) for 40 min, then 100 % eluent B for 3 min; the mobile phase flow rate – 100 μL/min; the thermostat temperature – 40°C; detection was carried out at 8 wavelengths (210, 220, 230, 240, 250, 260, 280, 300 nm).Results. The retention time of amitriptyline was 22.80 min; the absorbance ratios Sλ/S210 were also set as addition-al option to increase the reliability of identification. The calibration curve was represented by the dependence of a peak area (S, mm2) against concentration (c, μg/μL) and described by the regression equation у = 0.00514 × x. The method showed linearity in the range of 1.0–100.0 μg/mL. The correlation coefficient was lower than 0.99. The LOD and LOQ values were calculated from the parameters of the calibration curve, they were 0.3 μg/mlL and 0.9 μg/mL, respectively. The accuracy and precision of the method developed were determined at three concentration levels (low, middle, high) within one day (intraday); RSD did not exceed 1.0 % across the full concentration range studied when analyzing model solutions.Conclusions. The sensitive and specific method for the quantitative determination of amitriptyline using the HPLC-MWD method has been developed. The method meets the requirements set to techniques recommended for use in clinical and forensic toxicology, and it has been confirmed by a number of the validation parameters. The HPLC-MWD method developed can be recommended for implementation into the practice of regional bureaus of forensic medical examination and clinical and diagnostic laboratories of regional drug addiction centers

Мета – розроблення чутливої та специфічної методики ВЕРХ-MWD визначення амітриптиліну, придатної для застосування в біоаналітичних дослідженнях у клінічній та судово-медичній токсикології.Матеріали та методи. Аналіз проводили на мікроколонковому рідинному хроматографі «MiLiChrome A-02», з’єднаному з двопроменевим багатохвильовим УФ-спектрофотометром, за таких умов: колонка 2×75 мм ProntoSIL 120-5-C18 AQ, 5 мкм; градієнтний режим елюювання з лінійним градієнтом, елюент А (5 % ацетоні-трилу та 95 % перхлоратного буферу) до елюенту В (100 % ацетонітрилу) протягом 40 хв, потім 100 % елюент В протягом 3 хв; швидкість потоку рухомої фази – 100 мкл/хв; температура термостату – 40°C; детектування про-водилося на 8 довжинах хвиль (210, 220, 230, 240, 250, 260, 280, 300 нм).Результати та їхнє обговорення. Час утримування амітриптиліну становив 22,80 хв; також було визна-чено спектральні відношення Sλ/S210 як додатковий параметр для підвищення надійності ідентифікації. Калібру-вальний графік був представлений залежністю площі піка (S, мм2) від концентрації (c, мкг/мкл) та описувався рівнянням регресії у = 0,00514 • x. Діапазон лінійності становив 1,0–100,0 мкг/мл. Коефіцієнт кореляції був нижчим за 0,99. Значення LOD та LOQ були розраховані за параметрами калібрувального графіка, вони ста-новили 0,3 та 0,9 мкг/мл відповідно. Точність та прецизійність розробленої методики було визначено на трьох концентраційних рівнях (низькому, середньому, високому) протягом одного дня (intraday); RSD не перевищував 1,0 % у всьому досліджуваному діапазоні концентрацій під час аналізу модельних розчинів.Висновки. Розроблено чутливу та специфічну методику кількісного визначення амітриптиліну за методом ВЕРХ-MWD. Методика відповідає вимогам, установленим до методів, рекомендованим для використання в клі-нічній та судово-медичній токсикології, що було підтверджено низкою валідаційних параметрів. Розроблена методика ВЕРХ-MWD може бути рекомендована для упровадження в практику обласних бюро судово-медичної експертизи та клініко-діагностичних лабораторій обласних наркологічних диспансерів