A novel luminol-based chemiluminescence method for detecting acetylcholine

Abstract

Мета. Розробити новий простий неферментний метод визначення ацетилхоліну (АХ) за допомогою хемілюмінесцентної реакції люмінолу в умовах ферментативного гідролізу ацетилхоліну (рН 8,5). Експериментальна частина. Запропонований метод заснований на реакції пергідролізу АХ з надлишком перекису водню з утворенням пероцтової кислоти. Останній далі визначався ефектом активації реакції хемілюмінесцентного окислення люмінолу в присутності гідрогену пероксиду. Аналітичним сигналом була сумарна люмінесценція (Σ), зареєстрована протягом певного часу. Результати і обговорення. Діапазон рН аналітично застосовної системи становив від 8,2 до 8,5. Також вивчався вплив інкубаційного періоду ACh + H2O2 на хід реакції. Збільшення інкубаційного періоду підвищило чутливість методу (межа виявлення (LOD)), але з практичних причин (особливо швидкості виявлення) та практичного досвіду інкубаційний період був встановлений на позначці 30 хв. Лінійна залежність спостерігалась у діапазоні концентрацій ацетилхоліну хлориду (0,8 - 2,8) × 10-4 моль / л. При визначенні ацетилхоліну хлориду в діапазоні концентрацій (1,1 - 2,2) × 10-4 моль / л відносне стандартне відхилення (RSD) не перевищувало 3% ((X - μ) × 100% / μ = –0,5… + 0,5 %). Обмеження кількості (LOQ, 10S) становило 7,7 × 10-5 моль / л. Висновки. Запропоновано новий неферментативний кінетичний метод для хемілюмінесцентного визначення ACh у водних розчинах та фармацевтичному складі Acetylcholinchlorid Injeel®. Цей метод є простим, швидким, недорогим і, отже, придатним для рутинного контролю якості АХ в лабораторіях лікарень, фармацевтичної промисловості та науково-дослідних установ. Ключові слова: ацетилхолін; метод хемілюмінесценції

Цель. Разработать новый простой неферментные метод определения ацетилхолина (АХ) с помощью Хемилюминесцентный реакции люминола в условиях ферментативного гидролиза ацетилхолина (рН 8,5). Экспериментальная часть. Предложенный метод основан на реакции пергидролиза АХ с избытком перекиси водорода с образованием пероцтовои кислоты. Последний дальше определялся эффектом активации реакции хемилюминесцентного окисления люминола в присутствии пероксида водорода. Аналитическим сигналом была суммарная люминесценция (Σ), регистрируемая в течение определенного времени. Результаты и обсуждение. Диапазон рН аналитически приемлемой системы составлял от 8,2 до 8,5. Также изучалось влияние инкубационного периода ACh + H2O2 на ход реакции. Увеличение инкубационного периода повысило чувствительность метода (предел обнаружения (LOD)), но по практическим причинам (особенно скорости обнаружения) и практического опыта инкубационный период был установлен на 30 мин. Линейная зависимость наблюдалась в диапазоне концентраций ацетилхолина хлорида (0,8 - 2,8) × 10-4 моль / л. При определении ацетилхолина хлорида в диапазоне концентраций (1,1 - 2,2) × 10-4 моль / л относительное стандартное отклонение (RSD) не превышало 3% ((X - μ) × 100% / μ = 0,5 ... + 0 , 5%). Ограничение количества (LOQ, 10S) составило 7,7 × 10-5 моль / л. Выводы. Предложен новый неферментативными кинетический метод для хемилюминесцентного определения ACh в водных растворах и фармацевтическом составе Acetylcholinchlorid Injeel®. Этот метод является простым, быстрым, недорогим и, следовательно, пригодным для рутинного контроля качества АХ в лабораториях больниц, фармацевтической промышленности и научно-исследовательских учреждений. Ключевые слова: ацетилхолин; метод хемилюминесценции.

Aim. To develop а new simple non-enzymatic method for the determination of acetylcholine (ACh) by the chemiluminescent reaction of luminol under conditions of the enzymatic hydrolysis of acetylcholine (pH 8.5). Experimental part. The method proposed is based on the perhydrolysis reaction of ACh by the excess of hydrogen peroxide with the formation of peracetic acid. The latter was further determined by the activation effect of the luminol chemiluminescent oxidation reaction in the presence of hydrogen peroxide. The analytical signal was the summary luminescence (Σ) registered within certain time. Results and discussion. The pH range of the analytically applicable system was from 8.2 to 8.5. The effect of ACh + H2O2 incubation period on the reaction progress was also studied. The increase of the incubation period enhanced the sensitivity of the method (the limit of detection (LOD)), but because of practical reasons (especially the detection speed) and practical experience the incubation period was set to 30 min. The linear dependence was observed in the acetylcholine chloride concentration range of (0.8 – 2.8) × 10-4 mol/L. While determining acetylcholine chloride in the concentration range of (1.1 – 2.2) × 10-4 mol/L the relative standard deviation (RSD) did not exceed 3 % ((X – μ) × 100 %/μ = –0.5…+0.5 %). The Limit of Quantitation (LOQ, 10S) was 7.7 × 10-5 mol/L. Conclusions. A new non-enzymatic kinetic method for the chemiluminescent determination of ACh in aqueous solutions and the pharmaceutical formulation Acetylcholinchlorid Injeel® has been proposed. This method is simple, fast, inexpensive, and thus appropriate for the routine ACh quality control in the laboratories of hospitals, pharmaceutical industries and research institutions. Key words: acetylcholine; chemiluminescence method.