Теоретичне обґрунтування та розробка ліпосомальних лікарських препаратів у формі ін’єкційного розчину та спрею на основі нанобіотехнології

Abstract

Дисертація присвячена теоретичному обґрунтуванню і розробці ЛП у формі ін’єкційного розчину на основі ессенціальних фосфоліпідів для лікування захворю-вань печінки та у формі спрею на основі концентрату депротеїнізованого дермального шару шкіри свиней і фосфатидилхоліну для лікування ран, що довго не загоюються. Запропоновано методологію створення ЛП на основі нанобіотехнології і ме-тодів фізики поверхні. Вперше розроблено субстанцію «Концентрат депротеїнізо-ваного дермального шару шкіри свиней» (КДДШШС) і спрей на її основі під умо-вною назвою «Ефіаль», який знаходиться на третій фазі клінічних досліджень (лист № 26/7891 від 18.09.2015 р.). На підставі фізичних, фізико-хімічних, технологічних і фармакологічних досліджень розроблено технологію ін’єкційного розчину «Л’есфаль», який до-зволено до медичного застосування (реєстр. № UA/123117/01/01 зі змінами від 05.12.2014 р. № 939). Доведена можливість використання методів фізики поверхні у постадійному контролі технології ЛП, уперше запропоновано експрес-метод ви-значення етанолу в парентеральних розчинах, який упроваджено у підрозділах ПАТ «Фармак» (акт впровадження від 08.03. 2014 р.). Розроблено кількісне визначення пептидів, які входять до складу спрею «Ефіаль», методом тонкошарової хроматографії дот-перенесених на нітроцелюло-зну мембрану зразків препарату з подальшою фотометричною денситометрією. Визначено показники якості препаратів, вивчено умови їх зберігання і терміни придатності. Узагальнено, поглиблено і сформульовано вимоги до виробництва і контролю якості ліпосом, на підставі яких уперше в Україні розроблено загальну фармакопейну статтю «Ліпосомальні лікарські засоби», яку внесено до ДФУ 2.0. Новизна досліджень захищена 4 патентами України.

Диссертация посвящена теоретическому обоснованию и разработке ЛП в форме инъекционного раствора на основе эссенциальных фосфолипидов для ле-чения заболеваний печени и в форме спрея на основе концентрата депротеинизи-рованного дермального слоя кожи свиней и фосфатидилхолина для лечения долго не заживающих ран различного происхождения. Впервые разработана субстанция «Концентрат депротеинизированного дер-мального слоя кожи свиней» (КДДСКС) на основе сырья животного происхожде-ния (патент № 66570 от 10.01.2012 г.) и проведена его стандартизация. Разработа-на спектрофотометрическая методика и процедура валидации количественного определения углеводов суммарного биопрепарата. На основе физических, физико-химических, технологических и фармаколо-гических исследований впервые теоретически и экспериментально обоснован со-став и технология липосомального ЛП в форме спрея на основе КДДСКС и фос-фатидилхолина из соевых бобов под условным названием «Эфиаль» (патент Ук-раины № 101235 от 11.03.2013 г.). Экспериментально обоснован рациональный способ получения препарата «Эфиаль» – метод высокого давления. Доказана его стабильность в диапазоне рН 4,0-6,5. Изоэлектрическая точка находится в пределах 2,9-3,05. Значение дзета-потенциала составляет более -30 мВ, что позволяет прогнозировать стабильность пре-парата. Проведено масштабирование процесса фильтрации спрея «Эфиаль». Установ-лены параметры фильтрации: фильтр SARTOPORE 2 (0,45 ± 0,2) micron с двухслой-ной мембраной, постоянным давлением 1 мБар, температурой (20,0 ± 2,0) °С. Разработана технология фосфолипидной наносистемы эмульгированных мицелл и липосом с размером частиц 30-50 нм в лекарственной форме – инъекци-онный раствор «Л’есфаль» (патент Украины № 97742 от 12.03.2012 г.). Установлено, что критическим параметром контроля процесса получения липидной пленки является содержание примесей лизофосфатидилхолина и спирта этилового. Определены факторы, препятствующие образованию примесей: время (45 мин.), температура (43 °С), величина вакуума (не менее 14 гПа), скорость вращения колбы (50 об/мин.), количество циклов азота (4). Разработаны технологические инструкции / протоколы приготовления се-рий, производственная рецептура, инструкции по упаковке, методики контроля качества на ЛП. Технологии разработанных лекарственных препаратов апробиро-ваны (спрей «Эфиаль») и внедрены («Л’есфаль») в промышленное производство ПАО «Фармак» (письмо № 26/7891 от 18.09.2015 г.). Раствор для инъекций «Л’есфаль» разрешен к медицинскому применению (рег. № UA/123117/01/01 с изменениями от 05.12.2014 г. № 939). Спрей «Эфиаль» находится на третьей фазе клинических исследований. Показана возможность использования методов физики поверхности (дина-мическое светорассеивание, электрофоретическое светорассеивание, ДСК, ИК-Фурье спектроскопия, осмоляльность) в постадийном контроле технологии ЛП. Впервые предложен экспресс-метод определения этанола в парентеральных рас-творах (патент Украины № 75076 от 26.11.2012 г.). Методика определения кон-центрации спирта этилового в парентеральных растворах внедрена в подразделе-ниях ПАО «Фармак» (акт внедрения от 08.03. 2014 г.). Проведен теоретический анализ механизмов блокировки пор мембранных фильтров и масштабирование процесса фильтрации разработанных препаратов. Установлена доминирующая модель фильтрации в предложенных препаратах – модель полной блокировки пор. Доказана возможность использования метода ДСК для определения качест-ва фильтрации, а именно установлены причини потерь (до 15 %) основных и вспомогательных веществ во время фильтрации препарата «Л’есфаль» (отличия в теплофизических характеристиках новых фильтров). Установлены основные па-раметры фильтрации, которые уменьшают потери до 2 %. Впервые разработано количественное определение пептидов, которые вхо-дят в состав спрея «Эфиаль» методом тонкослойной хроматографии дот-перенесенных на нитроцеллюлозную мембрану образцов препарата с последую-щей фотометрической денситометрией. С помощью выполнения параллельных экспериментальных исследований двумя разными методами (SDS-электрофорез пептидов в капилляре и адсорбционная хроматография на мембранах) оптимизи-рована методика определения и контроля содержания пептидов в препарате. Разработаны и валидированы методики количественного определения компо-нентов препаратов «Эфиаль» и «Л’есфаль» методом жидкостной хроматографии. Определены условия хранения (температура (5,0 ± 3,0) °С) и сроки годно-сти (2 года) разработанных ЛП, которые обеспечивают их стабильность в течение хранения и использования. Обобщены и сформулированы требования к производству и контролю каче-ства липосом, впервые в Украине разработана общая фармакопейная статья «Ли-посомальные лекарственные средства», которая включена в ГФУ 2.0 (письмо ФЦ МЗ Украины № 11/977-5 от 24.06.2015 г.). Разработаны, утверждены ПК «Фармация» МЗ и НАМН Украины (протокол № 93 от 28.10.2015 г.) и изданы методические рекомендации «Використання ме-тодів фізики поверхні для експрес-контролю технологічного процесу і стандарти-зації якості ліпосомальних препаратів», которые внедрены на ПАО «Фармак» (акт внедрения от 30.11.2015 г.). Обобщены биологические исследования, которыми установлена гепатопро-текторная активность раствора для инъекций «Л’есфаль», регенеративное и рано-заживляющее действие спрея под условным названием «Эфиаль». Фрагменты научных исследований внедрены в учебный процесс фармацев-тических вузов и факультетов Украины.

The thesis is devoted to theoretical substantiation and development of liposomal drugs in the form of solution for injections on the basis of essential phospholipids for the treatment of liver diseases and in the form of a spray based on deproteiniated dermal layer of skin to treat fever lasted wounds. The first time the methodology of drugs crea-tion based on nanotechnology methods and surface physics was suggested. Developed substance «Concentrate dermal layer of the skin of pigs» and spray on its basis code-named «Efial», which is on the third phase of clinical trials (letter from 09.18.2015 № 26/7891). The technology of injection solution «L'esfal», which allowed for medical use (Reg. № UA 123117/01/01, amended on 05.12.2014 № 939). The possibility of using methods of surface physics in stepwise control of drugs technologies was shown, first proposed rapid method for determining ethanol in parenteral solutions, which put into production. Developed quantification of peptides, which are part of spray “Efial”. Defined quality indicators of the drugs and their storage terms and shelf life. Overview, depth and formulated requirements for production and quality control of liposomes, based on which for the first time in Ukraine developed general pharmacopoeia article "Liposomal drugs", which harmonized with Eu. Ph.