Наукове обґрунтування та розробка ліпосомальних протипухлинних лікарських засобів на основі іринотекану і оксаліплатину

Abstract

Дисертацію присвячено науковому та експериментальному обґрунтуванню складу і технології виробництва двох ліофілізованих ліпосомальних форм іринотекану гідрохлориду та оксаліплатину, призначенних для лікування онкологічних захворювань. Запропоновано науково–практично обґрунтовану модель проведення фармацевтичної розробки ЛЛФІ та ЛЛФО. Запропоновано загальну методологію визначення ступеня інкапсуляції для водорозчинних АФІ ЛЛФІ та ЛЛФО методом ВЕРХ в її гель-фільтраційному варіанті. Аналітичні методики розроблено, валідовано та апробовано. Методики використовуються як при контролі ГЛЗ, так і у проміжному технологічному контролі виробництва. Проведено експеримент з визначення складу ліпідної мембрани та вибору оптимального кріопротектору. Експериментально обґрунтовано склад ліпідного бішару розроблених препаратів. Доведено, що склад 80 / 20, ЕРС / Chol, із концентрацією 20 мг/мл є оптимальним з погляду розміру частинок та ступеня інкапсуляції для ЛЛФІ. Склад EPC / Chol / DPPG, 50 / 20 / 30 із концентрацією 20 мг/мл у кінцевому продукті є оптимальною для ЛЛФО. Найкращім кріопротектором було визначено трегалозу дигідрат у концентрації 8 % (мас.). Досліджено способи отримання моноламілярних ліпосом із розміром 80–120 нм методами ультразвукового озвучування та екструзії при високому тиску. Доведено перевагу методу екструзії. Метод оптимізовано з огляду на розмір частинок, склад ЛЛФІ та ЛЛФО. Досліджено кінетику інкапсуляції іринотекану гідрохлориду в ліпосоми. Розроблено МКЯ для ЛЛФІ та ЛЛФО. Запропоновано та апробовано технологічну схему отримання препаратів. Проведено масштабування розроблених технологій. Надано рекомендації щодо методів очищення обладнання при виробництві препаратів на одній дільниці. Доклінічне вивчення було проведено на базі ЗАТ «Санкт-Петербурзький Інститут Фармації» у необхідному обсязі: протипухлинна активність in vitro на цільових видах перещеплюваних клітин; загальна токсичність, специфічні види токсичності – тест ДНК-комет, тест Еймса на мутагенність, імунотоксичні властивості. Вперше за допомогою доклінічних in vitro та in vivo випробувань показано, що у порівнянні із неліпосомальними розчинами для ін’єкцій іринотекану й оксаліплатину, їх ліпосомальні форми мають менші показники токсичності при однаковій протипухлинній активності. Отримано дозвіл на проведення клінічних досліджень. За запропонованою технологією виготовлено серії препарату «Іринотекан ліпосомальний, ліофілізат для приготування емульсії для інфузій» в умовах GMP для клінічного вивчення та успішно проведено І фазу його клінічних досліджень.

Диссертация посвящена научному и экспериментальному обоснованию состава и технологии производства двух лиофилизированных липосомальных форм иринотекана гидрохлорида и оксалиплатина, предназначенных для лечения онкологических заболеваний. Предложено общую методологию определения степени инкапсуляции для водорастворимых АФИ иринотекана гидрохлорида и оксалиплатина методом ВЭЖХ в ее гель-фильтрационном варианте. Аналитические методики разработаны, валидированы и апробированы. Проведен эксперимент по определению состава липидной мембраны и оптимального криопротектора. Определены внутренний объём липосом в ЛЛФИ и концентрация иринотекана гидрохлорида внутри липосом. На основании исследований предложена эффективная технология лиофильной сушки препаратов. Исследована устойчивость липосомальной эмульсии после регидратации, предложены пути по повышению термодинамической устойчивости за счет увеличения дзета – потенциала. Исследована кинетика инкапсуляции иринотекана гидрохлорида в липосомы. Разработаны МКК для препаратов «Иринотекан липосомальный, лиофилизат для приготовления емульсии для инфузий» и «Оксалиплатин липосомальный, лиофилизат для приготовления емульсии для инфузий». Предложена и апробирована технологическая схема получения препаратов. Даны рекомендации к методам очистки оборудования при производстве липосомальных препаратов на одном производственном участке. Доклиническое изучение было проведено на базе ЗАО «Санкт-Петербургский Институт Фармации» в необходимом объеме: противоопухолевая активность in vitro на целевых видах перевиваемых клеток; общая токсичность, специфические виды токсичности - тест ДНК-комет, тест Эймса на мутагенность, иммунотоксические свойства. Проведены доклинические исследования разработанных липосомальных препаратов, на основании которых получено разрешение на проведение клинических исследований. Успешно проведена I фаза клинических испытаний препарата «Иринотекан липосомальниый, лиофилизат для приготовления емульсии для инфузий».

The thesis is devoted to the scientific and experimental substantiation of the composition and technology of the production of two lyophilized liposomal forms of irinotecan hydrochloride and oxaliplatin intended for the treatment of cancer. The review of scientific world literature on the problem of development and creation of cytostatic forms of medicine was conducted. A scientifically-substantiated model of conducting pharmaceutical development of LLFI and LLFO is proposed. Based on the results of physical and chemical research the concentration of the active substance in the developed preparations - irinotecan hydrochloride and oxaliplatin has been substantiated. As a result of pharmaco-experimental experimental studies, the stability of substances in the range of pH values, in which the development of drugs was planned, was investigated. The optimal pH range of 1,9-5,0 for irinotecan hydrochloride is proposed, and oxaliplatin is stable in an aqueous solution. The study of active loading of irinotecan hydrochloride by the method of "chemical gradient" was conducted. The technologies of "chemical ammonium gradient" and "chemical pH gradient" were tested. On the basis of the experimental data obtained, the advantage of the technology of the "chemical pH gradient" as the degree of encapsulation and the stability of the active substance during the technological cycle for LLFI has been proved. The advantage of the technology of "passive capture" in combination with the "ionic sorption" AFI method on lipid bilayer in the case of LLFI is proved. A general methodology for determining the degree of encapsulation for water-soluble AFI LLFI and LLFO by the HPLC method in its gel filtration variant is proposed. Analytical techniques have been developed, validated and tested. The methods are used both in the control of finished medicinal product, and in the intermediate technological control of production. An experiment was conducted to determine the composition of the lipid membrane and to select an optimal cryoprotectant. The composition of the lipid bichar of the developed drugs is experimentally substantiated. It has been proved that the composition of 80/20, EPC / Chol, at a concentration of 20 mg / ml is optimal in terms of the size of particles and the degree of encapsulation for LLFI. The composition of EPC / Chol / DPPG, 50/20/30 at a concentration of 20 mg / ml in the final product, is optimal for LLFO. Trehalose dihydrate was identified as the best cryoprotectant in a concentration of 8% (wt.). Methods of obtaining monolamilary liposomes with the size of 80-120 nm by methods of ultrasonic sounding and extrusion at high pressure have been investigated. The advantage of the extrusion method is proved. The method is optimized due to the size of the particles, the composition of LLFI and LLFO. The internal volume of liposomes in LLFI as well as the concentration of irinotecan hydrochloride within the liposome has been determined. The existing technologies of creating a "chemical gradient" on the lipid bilayer have been analyzed, resulting in the method of "pH gradient", which includes: homogenization of high pressure, ultrafiltration and lyophilization, recognized as the most technological with high scalability. The method is tested on the size of the series up to 5 liters of finished product. On the basis of researches an effective technology of lyophilic drying of preparations is offered. The stability of the liposomal emulsion after rehydration is investigated, ways have been proposed to improve thermodynamic stability by increasing the zeta potential. The kinetics of irinotecan hydrochloride encapsulation in liposomes was investigated. Developed by methods of quality control for LLFI and LLFO. A technological scheme for obtaining drugs is proposed and tested. The scale of the developed technologies is carried out. Recommendations on methods of cleaning the equipment in the manufacture of drugs at one site are given. Pre-clinical study was conducted on the basis of the JSC “St. Petersburg Institute of Pharmacy” to the extent necessary: antitumor activity in vitro on target species of transfected cells; general toxicity, specific toxicity types - DNA comet test, Ames test for mutagenicity, immunotoxic properties. For the first time, using preclinical in vitro and in vivo tests, it has been shown that in comparison with non-liposomal solutions for irinotecan and oxaliplatin injections, their liposomal form has lower toxicity rates with the same antitumor activity. Permission to conduct clinical trials has been obtained. The proposed technology produced series of drug "Irinotecan liposomal, lyophilizate for the preparation of an emulsion for infusion" in terms of GMP for clinical study and successfully conducted the first phase of its clinical studies.